四環素酶聯免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

1 使用目的：

本試劑盒用于飼料、魚、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中四環素殘留的定量檢測。

2 實驗原理

本試劑盒采用競爭ELISA方法，在微孔板包被有四環素偶聯抗原，加入四環素標準品或樣品，游離四環素與微孔條上預包被的四環素偶聯抗原互相競爭抗四環素抗體酶標記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍色變為黃色，用酶標儀在450nm波長下進行檢測，吸光值與樣品中四環素含量成反比，通過標準曲線計算樣品中四環素的含量。  

3 試劑盒組成 

3.1 預包被的四環素偶聯抗原的可拆酶標板：1塊（12孔×8條）。
3.2四環素標準品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是：0ppb, 3 ppb,9ppb,27 ppb,81 ppb,243 ppb

3.3抗四環素抗體酶結合物：1瓶（6ml）。
3.4顯色液A：1瓶（6ml）。
3.5顯色液B：1瓶（6ml）。
3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7樣本稀釋液：1瓶（10×,  6ml），用于樣品稀釋用。
3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9說明書一份。

4 需要而未提供的材料
4.1 設備
4.1.1波長450nm酶標儀。 
4.1.2粉碎機。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman No 1或相當的濾紙。
4.1.7微量移液器。
4.2 試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水。
4.2.2 甲醇。
5 貯存
5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍
5.2 未用完的微孔板應該密封干燥保存
6 注意事項
6.1 使用試劑盒前請仔細閱讀說明書。
6.2 不要使用過期試劑盒。
6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時。
6.4 標準品中含有四環素，使用時應特別注意，操作時應帶手套。
6.5 終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.6 不同標準品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗結果。
6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標準品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響實驗結果。
6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會影響實驗結果
6.9 混合試劑時應避免起泡。
7 工作液準備
7.1四環素標準品溶液：0ppb, 3 ppb,9ppb,27 ppb,81 ppb,243 pp

7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用

7.3 樣本稀釋液：備用
7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照
7.4 反應終止液：已備用
8 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴格按說明書操作，提取過程中應準確稀釋，否則會出現結果不準確，樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液
8.2強力振蕩3分鐘
8.3用Whatman No 1濾紙過濾
8.4取100µl處理后的樣品，加入400µl樣本稀釋液
8.5取50μl稀釋液進行分析（稀釋倍數10）

9 酶免分析步驟
9.1 實驗須知
9.1.1 實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復至室溫（25±2℃），時間約2小時。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準確度。
9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3 請不要改變分析程序
9.1.4 請使用精確的微量移液器
9.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序
9.1.6 ELISA結果的可重復性極大程度的取決于操作程序，請嚴格按照要求操作
9.1.7 為避免交叉污染，每個標準品和樣品均應使用不同的吸頭加樣
9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內表面
9.2 分析步驟
9.2.1 預先進行編號，標記B0、標準品和樣品的位置，推薦進行雙孔檢測
9.2.2 取所需數量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）
9.2.4 在B0孔中加入50µl0.0 ppb標準品溶液
9.2.5 在各標準孔中加入50μl的標準品溶液
9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗四環素抗體酶結合物
9.2.8 輕輕晃動反應板幾秒鐘。 
9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應板，可以減少雙孔誤差）
9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。
9.4 反應
9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50µl顯色液A，再加 50µl顯色液B；輕微晃動反應板使之*混勻
9.4.2 37℃溫浴10min
9.4.3 每孔中加入50µl終止液，混勻
9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結果在5min內讀取。
10 結果計算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0 ppb標準溶液的平均吸光度值
10.1.2以四環素濃度的對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。根據樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為四環素濃度的對數值，求得反對數即為測定液中四環素濃度C（ppb）
10.1.3由于樣品經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。 
10.2 半定量測定
10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。
10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。

11 特異性
物質 交叉反應
四環素 100%
金霉素 60%
土霉素 80%

12 試劑盒參數
本試劑盒檢測下限為3 ppb
B0吸光度*值應大于1.0
試劑盒吸光度板內誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
13 標準曲線模式（僅供參考）
試劑盒提供的標準曲線范圍為3ppb~243ppb。

14 分析限制
本試劑盒檢測為陽性的樣品應該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。